作为实验老兵，我想把自己在Transwell迁移/侵袭实验里踩过的坑都摊开说说。不论是看肿瘤转移，还是做药物筛选，这套实验确实是经典方法。但大家常碰到的问题我总结了一下，基本上都能归结到这6个点上。不管你是新手还是老手，看完这篇文章都能少走不少弯路。 Transwell侵袭实验的第一道坎，往往出在基质胶的铺制上。有些同学可能会说：“铺了胶，但细胞就是穿不过去”。这里面的关键在于浓度的把控，要是所有细胞都用同一浓度去处理，结果肯定不行。高侵袭力的细胞（比如MDA-MB-231）适合低浓度的胶液，大约5-10 μg/μL（1:8稀释原液）；而低侵袭力的细胞（比如MCF-7）就需要较高浓度的胶液，大约15-20 μg/μL（1:4稀释原液）。除了浓度，铺胶时还得防止胶层厚薄不一或者产生气泡，否则细胞穿透不均匀，可能会出现假阳性。我给个建议：铺胶前把枪头和离心管放在冰上预冷一下，这样能防止胶体提前凝固。滴加胶液的时候要垂直悬空滴，靠液体张力自然铺展，千万别直接触碰膜面。铺好后把它放到37℃培养箱里静置2-4小时让它充分凝固，用之前可以再给它用无血清培养基水化30分钟。 第二个大坑就是细胞状态不好。如果细胞已经老化传代次数太多（超过15代），那它的侵袭能力会大打折扣。还有的情况是细胞存活率低于90%，里面的死细胞释放出来的物质会干扰检测。如果实验前没有进行血清饥饿处理，血清里的生长因子也会刺激细胞迁移，导致背景很高。所以我建议大家一定要用对数生长期的细胞来做实验（传代后24-48小时），贴壁细胞在融合到80%的时候就传代。实验前可以用Calcein-AM染色看看活细胞比例是不是≥95%。迁移和侵袭实验前最好用无血清培养基把细胞饿12-24小时，把血清的影响给消除掉。 气泡问题也是个无声的杀手。如果小室和下层培养液之间有气泡夹着进去了，会阻断细胞和趋化因子的接触；上室里要是有气泡覆盖住了膜面，那个区域的细胞也没法迁移。为了避免这个问题，放入小室的时候动作得轻一点倾斜着慢慢放进去。加液的顺序也很重要：先加下室液体再加上室液体，沿着腔壁慢慢往里灌。放培养箱之前再仔细检查一遍有没有气泡有的话轻拍一下底板侧面就能把它赶出来。 细胞分布不均是个让人头疼的问题。有时候拍照的时候一个视野里全是细胞另一个却一个都没有。这多半是因为加样的时候悬液没摇匀导致的；或者是加样的时候直接打到了膜的中央。针对这个问题我觉得有个小技巧挺管用：每组加样前都要在管子里轻轻吹打混匀一下；然后顺着小室的内壁慢慢把悬液倒进去让它自然铺满膜面。建议大家每组设置3个复孔每孔随机选至少5个视野来拍照计数最后取平均值这样数据会比较稳定。 染色后出现背景深、有空洞或者细胞被擦掉的情况也不少见。有时候染色剂浓度太高或者时间太长就会导致背景很深看不清细胞；也有可能是用棉签擦的时候太用力把膜戳破了或者把已经迁移的细胞擦掉了。解决办法是把染色剂适当稀释一下（比如用0.1%的结晶紫），时间控制在15-30分钟内不要太长。染完色用PBS洗3次每次5分钟把多余的染料洗掉。擦拭未迁移细胞的时候要用湿润的棉签轻轻蹭一下力度要掌握好别损伤到膜面；擦拭前最好先在显微镜下看看那些没穿过的细胞长在哪里做到心里有数再动手。 最后就是数据方面的问题了：对照组和实验组没差异或者三次实验数据波动特别大。如果对照组和实验组都没啥区别那可能是因为细胞对趋化因子不敏感或者处理的时间太短了；也有可能是基质胶浓度太高细胞根本降解不了那么多的胶层。重复性差往往是因为操作细节没固定住比如悬液混匀程度不一样、孵育时间有长有短或者拍照选的视野不一样导致的误差太大。 为了避免这些问题我建议大家在设计实验的时候多设置几个对照组比如不含基质胶的迁移对照来区分一下真正的侵袭能力和基础迁移能力；通过预实验每隔6小时观察一下穿透率选择那个线性增长的时间段来做实验；计算侵袭指数的时候用含胶穿透率除以无胶穿透率来校正批次差异；每一步操作都严格按照固定的条件来减少变量的干扰。